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2018年3月21日，BioRxiv在線發(fā)表了一篇題為《Single-molecule optical mapping enables accurate molecular diagnosis of facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)》的文章，本研究由北京協(xié)和醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、美國費城兒童醫(yī)院、賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院及北京希望組生物科技有限公司共同合作完成，實現(xiàn)了基于Bionano 光學(xué)圖譜成像技術(shù)對面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（Facioscapulohumeral muscular dystrophy，F(xiàn)SHD）的精準(zhǔn)診斷。
研究背景
FSHD是一種繼杜氏肌營養(yǎng)不良癥和強直性肌營養(yǎng)不良癥后的第三位神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率約為1/20,000。大部分病人在20歲之前已有癥狀產(chǎn)生，臉、肩、上臂等部位的肌肉受其影響最為嚴(yán)重，且會出現(xiàn)逐漸加重的肌力減退及肌肉的萎縮。
FSHD患者病情進展緩慢，且具有很強的遺傳異質(zhì)性，即使家族內(nèi)成員，也會出現(xiàn)高度可變的臨床表型。大部分FSHD病例屬于家族遺傳，但1/3左右的病人表現(xiàn)為散發(fā)，為新發(fā)突變。因此FSHD患者不容易被確診或易被誤診為其他肌營養(yǎng)不良癥，其他肌營養(yǎng)不良癥也易被誤診為FSHD， 所以對FSHD患者進行遺傳性基因檢測至關(guān)重要。
雖然傳統(tǒng)診斷方法經(jīng)過不斷優(yōu)化，滿足了部分FSHD患者診斷需求。但面對長約3.3kb的D4Z4重復(fù)單元和幾個或幾十個的重復(fù)數(shù)目，以及區(qū)分與4q35相似的10q26非致病性同源序列，二代測序技術(shù)讀長短無法解決，目前大部分的診斷只能將基因組限制性酶切后借助脈沖電泳與Southern Blot，但是這些解決方案費時費力且無法精確定量重復(fù)數(shù)目及嵌和突變率。
本文利用Bionano SaphyrTM光學(xué)圖譜成像技術(shù)的超長讀長、無PCR過程、高通量等優(yōu)勢，開發(fā)了新型FSHD基因診斷方法，可正確區(qū)分4q35與10q26同源序列并精確計算D4Z4重復(fù)單元數(shù)目，同時可明確識別4qA、4qB變體結(jié)構(gòu)并準(zhǔn)確檢出嵌合體類型，從而使FSHD患者得到精準(zhǔn)診斷。
研究結(jié)果
Bionano光學(xué)圖譜成像技術(shù)通過酶切（Nb.BssSI 酶和Nt.BspQI 酶）和熒光標(biāo)記分析，可準(zhǔn)確區(qū)分4q35和10q26同源區(qū)域、精確計算D4Z4重復(fù)單元數(shù)目并識別4qA和4qB變體結(jié)構(gòu)。
患者（ID: P02）兩個等位基因分別存在3個D4Z4和28個D4Z4重復(fù)，且兩個等位基因均為4qA變體結(jié)構(gòu)
患者(ID: P01）兩個等位基因分別存在4.3±0.3個D4Z4和22.4±0.2個D4Z4重復(fù)，且兩個等位基因一個是4qA變體結(jié)構(gòu)，另一個是4qB變體結(jié)構(gòu)
本文對5例經(jīng)Southern blots檢測過的患者（Patient cohort 1）進行Bionano檢測，其中2例患者經(jīng)Southern blots檢測后被懷疑為嵌合體突變，但無法精確確定D4Z4重復(fù)單元數(shù)目和親本來源。研究通過Bionano光學(xué)圖譜成像技術(shù)對患者進行檢測，從而精確檢測出嵌合突變及D4Z4重復(fù)單元數(shù)目和親本來源，同時也證明了Bionano檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
此外，為進一步證明Bionano檢測FSHD的有效性，對2例疑似患有FSHD且未接受過其它FSHD分子診斷的患者（Patient cohort 2）進行檢測，。結(jié)果表明，其中1例患者為嵌合體突變（如下圖所示），D4Z4的重復(fù)單元數(shù)目分別為2（4qA）、15（4qB）、27（4qA），而另外1例患者的D4Z4重復(fù)單元數(shù)目為4（4qA）和20（4qA）。
開發(fā)FSHD的精準(zhǔn)檢測方法，一直是臨床研究的重點和難點。本文開拓性的應(yīng)用Bionano光學(xué)圖譜成像技術(shù)，配合完善的實驗檢測流程和生物信息分析方法，可對FSHD進行精準(zhǔn)診斷，不僅彌補了FSHD精準(zhǔn)檢測的空白，為我們提供了“眼見為實”的基因檢測，而且有助于加速對FSHD的深入研究，為FSHD病友帶來福音的同時，也為由復(fù)雜基因組結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致的其他遺傳病的研究提供了重要參考，開啟了更完整更真實的長片段DNA技術(shù)應(yīng)用于遺傳病診斷的新篇章，推動醫(yī)學(xué)檢測進入一個新的階段！
參考文獻
Yi Dai，Pidong Li，Zhiqiang Wang, Fan Liang, Fan Yang, Li Fang, Yu Huang, Shangzhi Huang, Jiapeng Zhou, Depeng Wang, Liying Cui, Kai Wang. Single-molecule optical mapping enables accurate molecular diagnosis of facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). BioRxiv preprint first posted online Mar. 21, 2018; doi: http://dx.doi.org/10.1101/286104.
